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TCR-T:实体瘤“攻坚手”的研发挑战与应对策略

2023-07-06

什么是TCR-T

肿瘤,一种令人闻之色变的疾病。纵观人类医学史,治疗肿瘤的方法从手术、放/化疗、靶向药物治疗再到时下大热的细胞治疗,无一不展现着人类面对这种恶疾时不断首页追求更有效、更安全治疗手段的勇气和智慧。

在目前的细胞疗法中,CAR-T无疑是成功的。它在血液瘤领域大杀四方,无论是已经上市的产品,还是处于临床开发阶段的疗法,所披露的数据都让人为之鼓舞。但它又不是完全成功的,实体瘤复杂的肿瘤微环境、狡猾的免疫逃逸机制、抗原异质性等因素,导致了CAR-T疗法对战实体瘤时,难以“近身”,不可避免的出现了“疲软”,这也是实体瘤难治的症结所在。

TCR-T疗法是指通过筛选和鉴定能特异性结合靶抗原的TCR序列,利用基因工程改造来自患者外周血的T细胞,然后将改造后的T细胞回输至患者体内,使其能特异性识别并杀伤表达抗原的肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤的目的。

2021年3月,Immatics公司宣布开发的TCR细胞疗法,在剂量递增临床试验的早期阶段就显示出抗癌活性。接受治疗的10名患者中,8位患者的肿瘤体积缩小,1位患者获得部分缓解,结果表明TCR-T疗法治疗实体瘤初步临床结果积极。2022年1月25日,由Immunocore公司研发的免疫疗法 Kimmtrak(tebentafusp-tebn)获得美国FDA批准上市,用于 HLA-A*02:01 阳性的无法切除或转移性葡萄膜黑色素瘤(mUM)成人患者,成为了第一个获得FDA批准的TCR疗法。TCR既能靶向细胞表面蛋白质,又能靶向胞内蛋白质,再加上多例临床研究进展,表明TCR-T是当仁不让的实体瘤冲关“种子选手”。

TCR-T疗法 VS CAR-T疗法

由于同为改造T细胞的过继细胞疗法,CAR-T疗法与TCR-T疗法常常被用来比较。

其一在于都是通过基因改造的手段提高T细胞受体对特异性癌症细胞抗原的识别能力和进攻能力,因此都被统称为“T细胞受体重新定向”技术(T cell receptor redirection);
其二是治疗流程类似,都是对患者自身的T淋巴细胞进行体外改造,然后回输到患者体内。

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而两者抗肿瘤反应的主要区别在于T细胞识别抗原时是否需要组织相容性复合体(MHC)参与。参考2022年发表于Trends in Cancer的综述,CAR-T和TCR-T的区别总结如下:

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总体来说,TCR-T可以靶向的靶点不仅包括细胞表面抗原,还包括细胞内部抗原。因此,TCR-T技术拥有比CAR-T更广泛的应用,特别在实体瘤领域,TCR-T更容易向实体瘤内部渗透,这也帮助TCR-T技术在实体瘤领域发挥更大的作用;而且,TCR-T引入的是完全人源化的结构不易引起机体的免疫排斥,抗抗体产生的概率低,安全风险也大大降低。

虽然TCR-T有上述种种优势,然而对于实体瘤治疗的研发依然面临许多挑战,如新靶点的开发、T细胞的获取和提纯、TCR亲和力的筛选、靶向毒性和导致肿瘤逃逸的靶抗原丢失等。目前,一些新的技术和工具正在应用于TCR-T的研究,有助于提高TCR-T的疗效和安全性。

1)TCR-T靶点/抗原筛选及验证

目前已证实能够用于TCR-T的有效和安全免疫治疗的肽抗原靶点非常有限,而有限的可用靶点也面临研发扎堆的风险。根据临床试验注册数据显示,TCR-T在研靶点中,NY-ESO-1占到开发总量的37%。为此,寻找新靶标成为TCR-T技术开发中亟待突破的挑战。而肿瘤细胞广泛共享的免疫原性新抗原的出现,可能构成未来TCR-T发展的可行靶标。

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高分辨质谱(HRAM MS)已被证明是促进从肿瘤细胞直接识别HLA-I结合肽的强大的高通量方法。在这种方法中,通过免疫沉淀(IP)从肿瘤组织或细胞系中分离HLA-I/肽复合物,然后从HLA-I分子和用于IP的抗体中分离结合肽抗原并进行检测。该方法允许每个肿瘤样本识别数千个肽靶点,目前已用于识别胶质母细胞瘤(GB)、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)和结直肠癌(CRC)等的HLA-I配体。

SCIEX拥有一系列的液相色谱串联质谱,可帮助进行TCR-T免疫原性新抗原的发现及验证。通过微流液相色谱分析技术,能够将经典的纳流色谱-质谱蛋白质组分析通量提高4倍及以上,适用于临床研究的大队列样本分析。使用SWATH DIA全景蛋白质组数据采集模式,则能将生物样本中可检测到的蛋白质组信息有效采集并做后续回溯分析。另外,SCIEX的QTRAP以及三重四极杆系列质谱系统采用MRM技术,可对复杂样品中的目标蛋白/多肽进行定量分析,线性动态范围最高可达6-7个数量级。

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另外,NGS技术也有助于识别和定位这类肿瘤靶点。采用全外显子组实博体育测序,结合计算预测算法,可以识别癌细胞中的特定遗传改变,并用以预测可能与患者个体HLA-I分子结合的潜在高亲和力表位,从而被T细胞识别。另一个经常使用的方法是肿瘤RNA测序,它可以选择具有高转录表达的新抗原。
贝克曼库尔特Biomek i7自动化工作站结合IDT 文库构建试剂盒可以全自动、高通量地完成实博体育/RNA文库构建全流程,有效提高日运行通量。

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2)T细胞的获取

对于T细胞的筛选,利用HLA-I多聚体法,可通过多聚体染色和流式细胞术分选直接分离抗原特异性CD8+T细胞。丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特中国智造的分选型流式细胞仪CytoFLEX SRT采用15 psi 超低压分选,能够确保稳定分选的同时提高细胞活性与更好的功能性,为后续的T细胞改造夯实基础。

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3)TCR亲和力调整

筛选最佳亲和力阈值的TCR也是一个难点,一方面需要尽可能筛选出那些对抗原具有高亲和力的TCR以增强免疫反应,但也需要控制其亲和力,超生理的TCR亲和力会损伤T细胞。

目前噬菌体展示技术已经在筛选高亲和力TCR方面显示出巨大的应用潜能。香雪精准在全球范围内率先将噬菌体展示技术应用于T细胞受体研究,发明了TCR的定向进化技术,并开发出了全球第一个人源高亲和可溶性TCR,使TCR识别pHLA的亲和性提高了100万倍以上。另外,Immunocore使用ImmTACs技术,获得高亲和力TCR。ImmTACs使用了工程改造的TCR为基础的靶向系统。TCR识别细胞内抗原,处理并递呈到细胞表面,形成peptide-HLA复合物(pHLA)。通过噬菌体展示技术可以显著提高TCR的亲和力,比抗原抗体结合的亲和还要高9倍左右。
丹纳赫生命科学拥有Biomek i 系列自动化工作站和QPix高通量微生物克隆筛选系统可以帮助进行繁琐的克隆筛选,提高工作效率。另外多功能酶标仪和CytoFLEX系列流式细胞仪可以进行大量的亲和力淘筛和验证的工作。

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QPix系列高通量微生物克隆筛选系统可进行自动加样、涂布、挑取、复制、点样、文库重排且具有高达3000个克隆/小时的挑取速度,能够大大减轻人力负担。

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4)输注T细胞的选择

在TCR-T细胞治疗中,输注T细胞的类型和分化水平直接影响效应细胞的功能与作用时间,在很大程度上决定了TCR-T细胞治疗的效果。CytoFlex流式细胞仪不仅能够进行淋巴细胞亚群和单细胞亚群的分析,还能分析T细胞的成熟阶段,包括初始、记忆、效应和终末分化阶段,精确把握不同阶段T细胞对治疗效果的影响。

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5 )安全性评价

当工程化TCR-T细胞改造完成后,其细胞活性、肿瘤杀伤活性的体外评价,需要合适的手段进行评估。SpectraMax 系列酶标仪能够用于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。


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▲ 细胞活性检测实验流程代表图

除此之外,TCR必须与患者的人类白细胞抗原(HLA)等位基因匹配才能识别pMHC并杀伤癌细胞。CytoFLEX 流式细胞仪能够监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,快速完成TCR和HLA之间的配型,保证安全性的同时缩短研发周期。

小结

尽管还面临着种种挑战,但相信随着基因工程技术的快速发展和创新, TCR-T有可能成为对抗实体瘤的有力工具,为患者带来更多治疗选择。

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